碱裂解法快速提取中药炒制品DNA的研究(1)
[摘要]该文旨在探索一种适用于中药炒制品DNA快速提取的方法。以氢氧化钠，1% PVP40和1% TritonX-100配制成碱裂解缓冲液，Tris-HCl为中和液，经加热裂解和中和2步提取不同炒制方法制备的中药炮制品的DNA，选择2种方法对DNA进行纯化，并以纯化后DNA作为模板利用通用引物进行PCR扩增。结果表明优化碱裂解法可简单快速的提取出药材DNA，槐米炒制品DNA质量浓度为(420.61±123.91) g·L-1，且使用5% Chelex-100树脂纯化可以提高DNA提取浓度。研究结果证明优化碱裂解法适用于中药炒制品的DNA快速提取。
[关键词]中药炒制品；DNA快速提取；碱裂解法；Chelex-100
多数中药材必须经过炮制方能入药[1]，加热是中药材炮制最重要的手段之一，其中最常用的方法是炒制和煅制。炒制不仅会改变动植物药材的化学成分，也会改变其DNA状态，造成药材DNA降解[2]，使得DNA提取难度增大，影响中药分子鉴别方法的使用。如何从中药炮制品中简单、快速的提取DNA是一个亟待解决的问题。研究者先后报道了CTAB法[3]、高盐低pH法[2]等，但这些方法耗时长，且需使用多种有机试剂，难以满足中药分子鉴别技术快速、简单、安全低毒的要求。
, 百拇医药
碱性裂解法能够使样本在强碱性及高温下迅速破坏细胞膜及核膜，使DNA释放。此方法与传统的CTAB法相比，具有操作简单，耗时短，无需使用氯仿、异戊醇等有机试剂，对人体无毒害作用等优点，已被广泛应用于动物[4]、植物[5-7]、微生物[8-9]。蒋超等[10]报道了基于碱裂解法的中药材快速DNA提取方法，即以氢氧化钠、PVP40和TritonX-100配制成碱裂解缓冲液，Tris-HCl为中和液，经加热裂解和中和两步操作，即可获得高质量的中药材DNA，但使用该配方进行中药炮制品DNA提取，其DNA质量有所下降。
本文以槐米炒制品为研究对象，对上述中药材快速DNA提取方法进行了改良，引入DNA快速纯化步骤，在10 min左右即可获得高质量的DNA，能满足PCR扩增及测序的要求。该方法同样适用于醋炙延胡索、酒炙当归、盐炙补骨脂、麸炒苍术等辅料炒制药材的DNA提取。
1 材料
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1.1 仪器试剂 漩涡振荡器(Scientific industrial公司)；离心机(Eppendorf公司，型号 5810R)；PCR仪(ABI公司，型号 7500)；电泳系统(北京市六一仪器厂)；紫外凝胶成像分析仪( Syngene公司) 。
氢氧化钠(北京化工厂)，PVP40( 聚乙烯吡咯烷酮40，北京江晨生物科技有限公司)；TritonX-100(曲拉通100，北京江晨生物科技有限公司)；rTaq DNA聚合酶(Takara公司)；琼脂糖(Invitrogen公司)；Tris(三羟甲基氨基甲烷，Takar 公司)；NaAc(醋酸钠，北京化工厂)。EasyPure Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物科技有限公司)，ChelexTM100 sodium form (Sigma公司)。
1.2 中药生品 槐米、延胡索、苍术生品购自河北省安国中药材市场，当归、补骨脂生品购自广西玉林中药材专业市场，按照《中国药典》2010年版一部鉴定，均符合要求。
, 百拇医药
1.3 槐米清炒品制备 分别取槐米生品，在不同温度下，经炒制不同时间，共制备28组样品，最低炒制温度为120 ℃，每升温10 ℃为1个温度处理，直至升温到250 ℃，共14个温度处理；每个温度处理分别炒制30，60 min 2组样品。
1.4 辅料炒制品制备 分别取延胡索、当归、补骨脂、苍术生品，按照《中国药典》2010年版一部，附录ⅡD炮制通则项下要求，制备醋炙延胡索、酒炙当归、盐炙补骨脂、麸炒苍术。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。
2 方法
2.1 碱裂解法[10] 称取药材粉末20 mg，加入200 μL裂解液(不同浓度NaOH，1%PVP，1% Triton-100)，使用漩涡振荡器振荡10～15 s混匀；煮沸10～15 s，取出；加中和液(0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)800 μL，涡旋混匀，12 000 r·min-1离心5 min，取上清。
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2.2 DNA纯化 Chelex-100[11]纯化：取上清50 μL，加入等量悬浮好的10%Chelex-100溶液，使用漩涡振荡器振荡10～15 s混匀，12 000 r·min-1离心5 min，取上清进行PCR反应。EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒纯化：取上清100 μL，按其说明书操作。
2.3 PCR扩增及电泳 将提取的DNA模板分别取原液、稀释10，50倍进行PCR扩增反应。使用通用引物rbcL，psbA-trnH，ITS2，matK(表1)。反应体系为25 μL：2.5 μL 2.5 mmol·L-110×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，10 mol·L-1引物各0.5 μL，0.2 μL rTaq酶，0.2 μL 1% PVP，0.3 μL 0.2% BSA[12]，1 μL DNA模板。反应结束后取5 μL反应液经EB染色的1.2%琼脂糖凝胶电泳20 min，Syngene型凝胶成像系统检测照相。, 百拇医药(郑琪 蒋超 黄璐琦 张志杰 李娆娆 陈康 袁媛 金艳)
[关键词]中药炒制品；DNA快速提取；碱裂解法；Chelex-100
多数中药材必须经过炮制方能入药[1]，加热是中药材炮制最重要的手段之一，其中最常用的方法是炒制和煅制。炒制不仅会改变动植物药材的化学成分，也会改变其DNA状态，造成药材DNA降解[2]，使得DNA提取难度增大，影响中药分子鉴别方法的使用。如何从中药炮制品中简单、快速的提取DNA是一个亟待解决的问题。研究者先后报道了CTAB法[3]、高盐低pH法[2]等，但这些方法耗时长，且需使用多种有机试剂，难以满足中药分子鉴别技术快速、简单、安全低毒的要求。
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碱性裂解法能够使样本在强碱性及高温下迅速破坏细胞膜及核膜，使DNA释放。此方法与传统的CTAB法相比，具有操作简单，耗时短，无需使用氯仿、异戊醇等有机试剂，对人体无毒害作用等优点，已被广泛应用于动物[4]、植物[5-7]、微生物[8-9]。蒋超等[10]报道了基于碱裂解法的中药材快速DNA提取方法，即以氢氧化钠、PVP40和TritonX-100配制成碱裂解缓冲液，Tris-HCl为中和液，经加热裂解和中和两步操作，即可获得高质量的中药材DNA，但使用该配方进行中药炮制品DNA提取，其DNA质量有所下降。
本文以槐米炒制品为研究对象，对上述中药材快速DNA提取方法进行了改良，引入DNA快速纯化步骤，在10 min左右即可获得高质量的DNA，能满足PCR扩增及测序的要求。该方法同样适用于醋炙延胡索、酒炙当归、盐炙补骨脂、麸炒苍术等辅料炒制药材的DNA提取。
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1.1 仪器试剂 漩涡振荡器(Scientific industrial公司)；离心机(Eppendorf公司，型号 5810R)；PCR仪(ABI公司，型号 7500)；电泳系统(北京市六一仪器厂)；紫外凝胶成像分析仪( Syngene公司) 。
氢氧化钠(北京化工厂)，PVP40( 聚乙烯吡咯烷酮40，北京江晨生物科技有限公司)；TritonX-100(曲拉通100，北京江晨生物科技有限公司)；rTaq DNA聚合酶(Takara公司)；琼脂糖(Invitrogen公司)；Tris(三羟甲基氨基甲烷，Takar 公司)；NaAc(醋酸钠，北京化工厂)。EasyPure Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物科技有限公司)，ChelexTM100 sodium form (Sigma公司)。
1.2 中药生品 槐米、延胡索、苍术生品购自河北省安国中药材市场，当归、补骨脂生品购自广西玉林中药材专业市场，按照《中国药典》2010年版一部鉴定，均符合要求。
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1.3 槐米清炒品制备 分别取槐米生品，在不同温度下，经炒制不同时间，共制备28组样品，最低炒制温度为120 ℃，每升温10 ℃为1个温度处理，直至升温到250 ℃，共14个温度处理；每个温度处理分别炒制30，60 min 2组样品。
1.4 辅料炒制品制备 分别取延胡索、当归、补骨脂、苍术生品，按照《中国药典》2010年版一部，附录ⅡD炮制通则项下要求，制备醋炙延胡索、酒炙当归、盐炙补骨脂、麸炒苍术。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。
2 方法
2.1 碱裂解法[10] 称取药材粉末20 mg，加入200 μL裂解液(不同浓度NaOH，1%PVP，1% Triton-100)，使用漩涡振荡器振荡10～15 s混匀；煮沸10～15 s，取出；加中和液(0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)800 μL，涡旋混匀，12 000 r·min-1离心5 min，取上清。
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2.2 DNA纯化 Chelex-100[11]纯化：取上清50 μL，加入等量悬浮好的10%Chelex-100溶液，使用漩涡振荡器振荡10～15 s混匀，12 000 r·min-1离心5 min，取上清进行PCR反应。EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒纯化：取上清100 μL，按其说明书操作。
2.3 PCR扩增及电泳 将提取的DNA模板分别取原液、稀释10，50倍进行PCR扩增反应。使用通用引物rbcL，psbA-trnH，ITS2，matK(表1)。反应体系为25 μL：2.5 μL 2.5 mmol·L-110×PCR buffer，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，10 mol·L-1引物各0.5 μL，0.2 μL rTaq酶，0.2 μL 1% PVP，0.3 μL 0.2% BSA[12]，1 μL DNA模板。反应结束后取5 μL反应液经EB染色的1.2%琼脂糖凝胶电泳20 min，Syngene型凝胶成像系统检测照相。, 百拇医药(郑琪 蒋超 黄璐琦 张志杰 李娆娆 陈康 袁媛 金艳)